Принципиально новый метод построения изображения молекул, известный как криоэлектронная микроскопия, дал нам самую четкую на сегодня картинку, и мы впервые получили возможность рассмотреть отдельные атомы в белке.
Добившись разрешения атомного масштаба с использованием криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ), ученые смогут подробно изучить механизмы и устройство протеинов, что невозможно было сделать другими методами визуализации, такими как рентгеновская кристаллография.
Об этом революционном достижении в конце пошлого месяца сообщили две лаборатории. Оно укрепит позиции крио-ЭМ как главного инструмента построения трехмерных моделей белков, говорят ученые. В конечном итоге эти структуры помогут исследователям понять, как работают белки в здоровом и больном организме, и позволят создать более совершенные лекарства без серьезных побочных эффектов.
«Это действительно знаковое событие, в этом нет сомнений. Больше открывать нечего. Это был последний барьер детализации», — говорит биохимик и специалист по электронной микроскопии Хольгер Старк (Holger Stark), работающий в немецком Геттингене в Институте биофизической химии имени Макса Планка и возглавивший одно из исследований. Вторым исследованием руководят структурные биологи Сьорс Шерес (Sjors Scheres) и Раду Арическу (Radu Aricescu), работающие в лаборатории молекулярной биологии Совета медицинских исследований в британском Кембридже. 22 мая оба исследования разместили на сервере препринтов bioRxiv.
«Настоящее „атомное разрешение" — это важнейший этап», — говорит структурный биолог Джон Рубинштейн (John Rubinstein) из Университета Торонто в Канаде. Получить структуры многих белков в разрешении атомного масштаба все равно будет очень сложно, потому что есть немало других проблем, таких как трансформируемость белков. «Эти исследования показывают, чего можно добиться, если преодолеть другие ограничения», — отмечает ученый.
Прорывая границы
Криоэлектронная микроскопия существует на протяжении десятилетий. С ее помощью определяют форму быстрозамороженных образцов, выстреливая по ним электронами и фиксируя полученные изображения. Достижения в технологиях обнаружения рикошетирующих электронов и в создании программ анализа изображений дали толчок «революции разрешения», которая началась примерно в 2013 году. Это позволило получить более четкое изображение белковых структур. Оно оказалось почти таким же, какое дает рентгеновская кристаллография. Это более старый метод определения трехмерной структуры биологических макромолекул посредством дифракции кристаллизованных белков, бомбардируемых рентгеновскими лучами.
Новое аппаратное и программное обеспечение позволило повысить разрешающую способность крио-ЭМ. Но для получения структур в атомном разрешении ученым все равно приходилось прибегать к рентгеновской кристаллографии. Однако на кристаллизацию белка уходили месяцы, а то и годы, а многие важные с точки зрения медицины белки вообще не создавали пригодные для изучения кристаллы. Криоэлектронная микроскопия же требует лишь одного — чтобы белок был в очищенном растворе.
Карты атомного разрешения достаточно точны, чтобы однозначно определить местоположение отдельных атомов в белке при разрешении примерно 1,2 ангстрема (1,2 × 10-10 м). Эти структуры помогают понять, как работают ферменты, а такое понимание позволяет определять препараты, препятствующие их активности.
Чтобы вывести крио-ЭМ на уровень атомного разрешения, два коллектива ученых работали с белком под названием апоферритин, который связывает железо. Поскольку этот белок неизменно стабилен, его сделали испытательным стендом для крио-ЭМ. Раньше рекордом была структура белка с разрешением 1,54 ангстрема.
Затем ученые воспользовались технологическими усовершенствованиями, чтобы получить более четкое изображение апоферритина. Команда Старка получила белковую структуру с разрешением 1,25 ангстрема, использовав прибор, обеспечивающий движение электронов с одинаковой скоростью до удара по образцу. Это повысило разрешение полученных изображений. Шерес, Арическу и их коллеги воспользовались другой технологией для обстрела образцов электронами, движущимися с одинаковой скоростью. Они также использовали технологию, снижающую шум после рикошета части электронов от образца, и более чувствительную камеру для обнаружения электронов. По словам Шереса, их структура в разрешении 1,2 ангстрема оказалась настолько полной, что они сумели разглядеть отдельные атомы водорода, как в белке, так и в окружающих его молекулах воды.
Старк уверен, что если соединить эти технологии, то разрешение удастся довести до одного ангстрема — но не более того. «С применением крио-ЭМ опуститься ниже одного ангстрема почти невозможно», — говорит он. Чтобы получить такую структуру при помощи существующих передовых технологий, надо «несколько сотен лет собирать данные, а еще понадобятся колоссальные вычислительные ресурсы и емкость памяти», считает научный коллектив Старка.
Ясно видеть картину
Шерес и Арическу также испытали свои усовершенствования на простой форме белка под названием ГАМК-рецепторы. Этот белок находится в оболочке нейронов, и именно он подвергается воздействию анестетиков общего действия, транквилизаторов и многих других препаратов. В прошлом году группа Арическу использовала крио-ЭМ, чтобы рассмотреть этот белок с разрешением 2,5 ангстрема. Но при помощи нового метода ученые добились разрешения 1,7 ангстрема, а в некоторых частях белка оно было еще лучше. «Такое впечатление, что с глаз упала пелена, — говорит Арическу. — При таком разрешении каждые пол-ангстрема открывают целую вселенную».
Им удалось увидеть в белке такие детали, каких никто раньше не видел, в том числе, молекулы воды в той его части, где находится вещество гистамин. «Это настоящая золотая жила для создания структурированных препаратов, — говорит Арическу, — потому что она показывает, как препарат может заменить молекулы воды. Это может привести к появлению лекарств с меньшим количеством побочных эффектов».
Создать карту ГАМК с разрешением атомного масштаба будет трудно, потому что гамма-аминомасляная кислота не так стабильна, как апоферритин, говорит Шерес. «Я думаю, это возможно, но практически это нереально», — отмечает он. Дело в том, что придется собрать огромные объемы данных. Однако другие усовершенствования, в частности, в методике подготовки белковых проб, помогут выйти на уровень атомного разрешения структуры ГАМК и других важных для биомедицины белков. Белковые растворы замораживаются на крохотных решетках из золота, а изменения в этих решетках помогут обеспечить еще большую стабильность белков.
«Все обрадованы и восхищены теми поистине поразительными результатами, которых добились коллективы из Института биофизической химии имени Макса Планка и лаборатории молекулярной биологии Совета медицинских исследований», — говорит специалист по криоэлектронной микроскопии из Токийского университета Радостин Данев (Radostin Danev). Но и он тоже согласен с тем, что подготовка образцов из наиболее неустойчивых белков будет представлять серьезную проблему для этой области исследований. «Достичь разрешения ниже полутора и даже двух ангстремов какое-то время можно будет только для устойчивых образцов», — заявляет он.
По мнению Шереса, новые достижения приведут к тому, что крио-ЭМ станет незаменимым инструментом в большинстве структурных исследований. Фармацевтические компании, жаждущие получить структуры в атомном разрешении, с еще большим желанием займутся криоэлектронной микроскопией. Однако Старк считает, что и рентгеновская кристаллография тоже сохранит свою привлекательность. Если белок удастся кристаллизовать (а это большое если), то можно будет довольно эффективно и быстро создавать его структуры, связанные с тысячами потенциальных препаратов. Но для получения достаточного количества данных по структурам с использованием крио-ЭМ очень высокого разрешения по-прежнему понадобятся часы и даже дни.
«По каждому из этих методов есть доводы „за" и „против", — говорит Старк. — Люди публикуют большое количество работ и обзоров, в которых говорится, что последние достижения в области криоэлектронной микроскопии обрекут на смерть рентгеновскую кристаллографию. Но я в этом сомневаюсь».
